StatQuest生物统计学 - Independent Filtering

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什么是Independent Filtering为何进行Independent FilteringedgeR和DESeq2是如何进行Independent Filtering的

什么是Independent Filtering

在edgeR和DESeq2中，原始的read count矩阵除了进行library normalization之外，还会进行Independent Filtering。Independent Filtering筛去一些不太可能有生物学差异的基因，而不管它的p值是否显著，以尽量降低假阴性结果。

为何进行Independent Filtering

对RNA-seq数据进行差异表达分析的时候，如果直接进行假设检验，那么由于基因数目众多，因而进行的多次统计学检验会增加假阳性的风险。以一般的统计学显著cutoff值0.05来说，每一次的假设检验都会有 5%的假阳性，随着假设检验的增加，那么假阳性风险会非常高，这种情形叫做多重比较。

当然实际情形下并不会出现很高的假阳性概率，原因在于edgeR和DESeq2都会对假设检验的p值进行FDR校正。所以假阳性的风险可以维持在5%以下。

FDR是一种校正思想，而不是具体的方法，下一周将会介绍FDR思想和其的一种具体实现方法Benjamini-Hochberg方法。

然而，虽然FDR可以控制假阳性概率，但是随着基因数目的增加，大量真实差异基因会被掩盖，也就是说假阴性概率提高了，而FDR是无法修正这种情形的。

而Independent Filtering就是为了降低假设检验的假阴性。

下面的例子说明了假阴性为何会随着基因数目的增加而增加。

假如从两个不同的正态总体中随机各挑选3个数字，并进行假设检验，差异显著性为0.05，那么会有5%的假阳性。进行上述模拟抽样统计，结果如下，949次抽样是显著的，而有51次抽样是得出两个样本不显著（I类统计学错误）。

上述的1000个抽样由于来自不同的正态总体，所以他们实际是有差异的，代表着差异基因。然后继续进行1000次模拟抽样，这次抽样来自同一总体，由于是同一总体，因此是代表无差异基因。根据5%的假阳性，那么会有约50次抽样显著，即便他们是来自于同一总体，原本是没有差异的。

下图代表合并上述两次抽样结果，1000个来自于不同总体的抽样和1000次来自于同一总体的抽样：

可以看出此时的阳性有抽样共有993个，其中真阳性是949个（来自于不同总体），假阳性是44个（来自于同一总体）。

由于是多重比较，实施FDR之后，则有846个阳性结果保留下来，其中真阳性827个，假阳性19个，假阳性率2%。

继续进行进行试验，将1000个来自于同一总体的抽样次数增加为5000个，下图为为其结果，1000个来自于不同总体的抽样和5000次来自于同一总体的抽样，并且已实施FDR：

此时的阳性结果256个，其中真阳性250个，假阳性6个，假阳性率2%。

继续进行进行试验，将5000个来自于同一总体的抽样次数增加为10,000个，下图为为其结果，1000个来自于不同总体的抽样和10,000次来自于同一总体的抽样，并且已实施FDR：

此时的阳性结果56个，其中真阳性54个，假阳性2个，假阳性率2%。

可以发现，随着模拟无差异基因的假设检验的数目的增加（1000, 5000, 10000），假阳性可以控制的非常好：2%，2%，4%，但是真阳性结果却被大量掩盖，从89%，26%到6%。所以从这个模拟实验中，可以非常合理的看出在RNA-seq分析中，如果不进行任何处理的话，将会有大量的真实差异表达基因被掩盖，假阴性增加。

edgeR和DESeq2是如何进行Independent Filtering的

幸运的是，Independent Filtering可以降低这种假阴性结果。

Independent Filtering的基本思想是将超低Read数的基因从数据集中移除，因为过低的Read数（如只有1、2个Read数）首先不太可能有生物学意义，其次即便有生物学意义，也不太可能测得准。

edgeR的Independent Filtering方法

edgeR会将在2个及以上样本中的CPM值大于1的基因保留，而剔除剩余的基因。

对于以下已转为CPM的read count矩阵，gene1在两个样本中CPM大于1，因此保留，gene2同理。gene3虽然在一个样本中有一个极大的CPM值103.3，但是由于只有一个样本CPM大于1，因此剔除，gene4、5同理。gene6在两个样本中CPM值大于1，因此也会保留，即使剩余的两个样本中CPM值为0。

然而需要说明的是，将CPM的cutoff值定位1，是非常武断的做法，这个CPM值会因到测序深度而有很大的影响，因此尝试几个CPM值是更好的方案。

什么是CPM？

CPM: Counts Per Million，它其实是只进行RPKM的第一部分，只进行测序深度标准化。

对于每一个Read，除以这个Read所在样本的总Read数，再乘以10^6即可。

举例来说，有以下Read count数据：

Control

gene1 65

gene2 5

gene3 0

... ...

样本Control共有5324112个Read。

那么gene1的CPM就是65/5324112*10^6=12.3，gene2的CPM是5/5324112*10^6=0.9，其他类推。

DESeq2的Independent Filtering方法

DESeq2不同于edgeR，它是根据每一个基因的平均CPM值决定的。

而且它会自动尝试众多的cutoff值，并在这些cutoff值给出最佳的cutoff值。具体来说，就是DESeq2会将根据CPM值将gene排序，然后尝试不同的分位数，将次分位数一下的基因剔除，然后计算此时的显著基因数量，并对这个“显著基因数量-分位数”曲线进行拟合（见下图，y为显著基因数量，下x轴为分位数，上x轴为分位数对应的CPM cutoff值），选出最佳的分位数。

参考资料

StatQuest课程：https://statquest.org/video-index/

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